1. TIPOS DE MICROSCOPIA:
1.1 Microscopia óptica normal (de campo brillante coloreado): El
material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el
contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera.
1.1.1 Microscopia de campo brillante: el material se observa sin
coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén
naturalmente coloreados.
El
microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa
en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión
del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz
que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen
aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando
aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se
utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas,
invisibles con iluminación normal.
1.1.2 Microscopia en contraste de fase: se usa principalmente para
aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin
colorear. Es ideal para especímenes delgados, o células aisladas. El
microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el
microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de
luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un
dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un
cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación
provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen
transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la
hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en
biología y medicina
1.1.3 Nomadismo, microscopia diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza
dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la
célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar
relieves de especímenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los
tratamientos de fertilización in-vito actuales. DI se usa cuando el espécimen
es muy grueso para usar contraste de fases
1.2 Microscopia de fluorescencia:
una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al
corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida
como rayas luminosas: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de
mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante.
Microscopio de fluorescencia:
Microscopio que incorpora una
lámpara especial, que actúa emitiendo una luz excitadora de los fluorhídricos
con los que se tiñen las muestras a observar, y que posee además un filtro
especial, que permite el paso de la luz emitida por el fluorhídrico.
1.3 Un microscopio con focal es
un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de la célula. Se basa
en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan
dos diafragmas con focales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de
enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. Se utiliza un láser
como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su volumen,
plano a plano, creando muchas imágenes unidimensionales que un ordenador
interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto.
Para observar preparaciones con
este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o marcarlas
con sustancias conjugadas con fluorhídricos, como los anticuerpos.
1.2.2 Técnicas
utilizadas en el con focal:
1.2.2.1 Marcajes
con múltiples floríferos
Suele ser lo más utilizado. En
este caso se detectan varios marcadores simultáneamente utilizando diferentes floríferos.
Lo más importante es que dichos floríferos tengan unos perfiles de excitación y
emisión lo menos solapan tes posible y tener el juego de filtros de emisión
adecuado que permitan separar perfectamente la emisión de los diferentes floríferos.
Asimismo es necesario disponer de las líneas de láser necesarias para excitar óptima mente todos ellos.
Todo esto es debido a que el
mayor problema que se encuentra en los marcajes múltiples es el del
“ doblegaros”, del que ya se ha hablado previamente. Es fundamental estar seguro
de que lo que se está observando en un canal procede de uno solo de los floríferos.
Para ello la emisión de cada floríferos se distribuye a un foto multiplicador independiente que dispone de unos filtros específicos para un determinado tipo
de floríferos. Es importante adquirir de manera secuencial los diferentes
canales, excitando individualmente los floríferos. De esta manera se consigue
una mejor separación entre los mismos. Es recomendable en cualquier caso
realizar los controles convencionales de auto fluorescencia (observando las
preparaciones en ausencia de anticuerpos) y de anticuerpos secundarios
(observando las preparaciones incubadas sólo con los mismos) para reconocer las
señales específicas. También conviene optimizar la disolución de los anticuerpos
primarios y secundarios para evitar artefactos. En la figura 6 se muestra un
ejemplo de marcaje triple.
1.2.2.2
Recuperación de la Fluorescencia Después del “P bachillerato” (FRAC).
Consiste en destruir la
fluorescencia en una muy pequeña región del campo de observación (ROÍ),
aumentando mucho el “ zoo” y haciéndole incidir una elevada intensidad de láser
durante un largo período de tiempo. A continuación, se disminuye de nuevo el
“ zoo” y la intensidad de láser, recogiendo desde ese momento imágenes cada
cierto tiempo (“ melaseis”). De esta manera se puede visualizar la difusión del
Floríferos hacia la zona carente
de fluorescencia, permitiendo estudiar la fluidez de membranas, el movimiento
de moléculas en la célula, et.
1.2.2.3
Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente (FREY).
Cuando dos floríferos se
encuentran muy próximos (entre 10 y 100 A la energía de la emisión de uno de
ellos (donador) puede ser transferida al segundo, siempre y cuando la longitud
de onda de la emisión del donador coincida con la de excitación del precepto De
manera que si ambos floríferos se encuentran lo suficientemente próximos,
excitando al donador se podrá detectar la emisión del acepto Otra
aproximación a esta técnica es estudiar la emisión del donador antes y después
de destruir la fluorescencia
Del aceptor
(“ bmachillerato”). Si se está teniendo lugar FREY la emisión del donador
disminuye puesto que la energía es transferida al aceptor. Si se destruye la
capacidad de excitación del aceptor la emisión del donador aumentará. Por
tanto, estas técnicas nos permiten en su conjunto el estudio de la interacción
entre proteínas que lleven acoplados floríferos ya que sólo si interaccionan
entre sí las proteínas los floríferos se encontrarán lo suficientemente
próximos como para detectar FRET.
2. POSIBLES
CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN.
Podemos enumerar diferentes
aspectos revisables para el diagnóstico de una
Mala imagen:
l. Verificar que la iluminación
sea la correcta.
2. Verificar que las lentes del
objetivo estén limpias.
3. Comprobar que entre el
diafragma de campo y el de abertura, no haya ningún filtro difusor.
4. El centrado del revólver porta
objetivos debe ser el correcto.
5. El portaobjetos y el
cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que el primero esté bien colocado,
y que no haya dos cubreobjetos superpuestos.
6. Verificar la limpieza de todo
el sistema óptico. Esto se puede efectuar haciendo girar por separado los
oculares que el microscopio posea, comprobando si las pequeñas motas de
suciedad se mueven Si es así, es que hay que limpiar el ocular.
Luego, habrá que hacer girar el
tubo ocular en su conjunto; éste no debe ser
Desmontado nunca, pero sí se
pueden limpiar cuidadosamente los prismas soplando sobre las superficies
accesibles. El objetivo puede limpiarse desenroscándolo ligeramente y
ayudándose de un pincel seco.
7. Comprobar que el aceite de
inmersión sea el suficiente, sin burbujas ni impurezas, y que no sea
fluorescente.
8. Asegurarse de que el objetivo
está bien enroscado.
9. Verificar el grosor del
cubreobjetos, portaobjetos y medio de montaje, que es decisivo, sobre todo en
medianos y grandes aumentos. Es importante, igualmente, no colocar dos
cubreobjetos superpuestos.
10. La montura del condensador
debe estar bien centrada y la frontal bien sujeta, en el caso de que sea
abatible. Comprobar que la cremallera esté bien apretada, para mantener la
posición.
11. La intensidad lumínica no
debe ser débil, ni excesiva. No hay que regularla nunca con el diafragma del
condensador.
12. Tener cuidado de no utilizar
objetivos de contraste de fases para observaciones de campo claro, sobre todo
cuando trabajamos con grandes aumentos.
13. Si el microscopio tiene
espejo, es necesario comprobar que la cara plana sea la que proyecte el haz
luminoso sobre el diafragma del condensador.
14. Utilizar una combinación
correcta entre el ocular y el objetivo, pues puede ocurrir que el ocular sea
demasiado potente.
15. Comprobar que la preparación
esté bien hecha, comparándola con una preparación test.
16. En contraste de fases, es
común el error en el centrado del anillo de iluminación.
Aunque éste puede descentrarse
debido a la geometría de las estructuras.
17. En observaciones con
fluorescencia, las fluorescencias parásitas que se pueden descubrir pueden ser
debidas a: el medio de montaje, al aceite de inmersión, una óptica inadecuada,
el uso de un filtro incapaz de cortar los rayos de excitación.
18. Si el medio
de montaje tiene un índice de refracción muy similar al del objeto incoloro,
éste no podrá verse, ni con contraste de fases, ni con contraste
Interferencial.
19. Si se observa una neblina
solamente en los bordes del campo, se deberá a una mala corrección de
esfericidad del campo por parte del sistema óptico.
20. La oscuridad del campo puede
darse por el incorrecto centrado del sistema de iluminación. Por eso, deberá
revisarse: la posición del espejo, la altura del condensador, la posición del
diafragma, que puede estar demasiado cerrado o descentrado, sobre todo en
monturas que permiten la iluminación oblicua.
21. Si se produce un
desplazamiento de la imagen cuando varía el enfoque, el problema se debe a un
defecto del microscopio, que puede afectar al juego del mando micrométrico, o a
una iluminación oblicua. Esto se soluciona rectificando la posición del espejo,
obteniéndose así una iluminación correcta.
22. Si se observa que la iluminación no es
homogénea, su causa puede ser el propio aparato (fallo de centrado, polvo o
manchas sobre el espejo o sobre las lentes del condensador) o a agentes
exteriores (barras de ventanas u objetos interpuestos en la trayectoria de los
rayos lumínicos).
ESTEBAN MARTINEZ ROJAS
